Encephalitozoon cuniculi u królików

Pasożyt, który zmienia zasady gry

Encephalitozoon cuniculi to jednokomórkowy, obligatoryjnie wewnątrzkomórkowy patogen z grupy Microsporidia, czyli mikrosporidium o pasożytniczym trybie życia ¹. Choć przez dziesięciolecia klasyfikowano go jako pierwotniaka, współczesne badania molekularne wskazują, że mikrosporydia są blisko spokrewnione z grzybami i w wielu ujęciach są traktowane jako silnie zredukowana linia w obrębie grzybów; w toku ewolucji zredukowały klasyczne mitochondria do szczątkowych organelli zwanych mitosomami (bez własnego genomu mitochondrialnego) i przystosowały się do obligatoryjnego pasożytnictwa wewnątrzkomórkowego ². Jego genom jest ekstremalnie uproszczony, zawiera około 2,9 Mb DNA i rzędu dwóch tysięcy genów kodujących białka, co plasuje go wśród najbardziej zredukowanych znanych genomów eukariotycznych. Ta redukcja genomowa odzwierciedla całkowitą zależność pasożyta od komórek gospodarza - utracił on większość szlaków metabolicznych i biosyntetycznych, pozostawiając jedynie te absolutnie niezbędne do przetrwania wewnątrz komórek żywiciela ²³.

Pierwszy opis tego patogenu pochodzi z 1922 roku, kiedy Wright i Craighead zidentyfikowali go jako przyczynę porażeń neurologicznych u królików laboratoryjnych w Stanach Zjednoczonych ¹⁴. Od tamtej pory organizm ten wykrywano u wielu gatunków zwierząt, głównie ssaków (w tym u ludzi, psów, kotów, gryzoni, lisów, koni i naczelnych), ale opisywano go także u innych grup gospodarzy; nazwy „rabbit/mouse/dog/human strain” mają charakter historyczno-umowny i nie wyznaczają ścisłej swoistości żywicielskiej ²⁵⁶. Wyróżnia się obecnie cztery główne genotypy: genotyp I („rabbit strain”), genotyp II („mouse strain”), genotyp III („dog strain”) oraz genotyp IV („human strain”), przy czym te nazwy nie oznaczają ścisłej swoistości żywicielskiej ani jednoznacznych granic geograficznych ³⁶. Co istotne, mimo że nazwy genotypów sugerują pewną specyficzność żywicielską, dane wskazują na niską swoistość gospodarza: u królików opisywano naturalne zakażenia co najmniej genotypami I-III, a „przypisanie” genotypu do gatunku ma charakter umowny ⁶.

Skala problemu - liczby, które zaskakują

Badania serologiczne prowadzone w różnych krajach i na różnych populacjach królików nieustannie dostarczają danych, które mogą wydawać się alarmujące dla osób nieznających specyfiki tego zakażenia. Szacuje się, że nawet do 80% królików domowych w Europie i Stanach Zjednoczonych posiada przeciwciała świadczące o kontakcie z tym pasożytem ⁷. W poszczególnych krajach europejskich wyniki wahają się znacząco w zależności od badanej populacji i zastosowanej metodyki, ale ogólny obraz jest spójny - E. cuniculi to patogen endemiczny, z którym zetknęła się większość populacji królików domowych.

W Wielkiej Brytanii klasyczne badanie Keeble i Shaw z 2006 roku wykazało obecność przeciwciał u 52% badanych królików towarzyszących ⁸, natomiast wcześniejsze badanie Harcourt-Brown z 2003 roku wskazywało na seropozytywność sięgającą nawet 59% ¹. W Słowenii kompleksowe badanie obejmujące lata 2017-2021 potwierdziło przeciwciała IgG i IgM u 65,6% z 224 przebadanych zwierząt ⁹. W Austrii odnotowano seropozytywność na poziomie 50-70% ¹, w Niemczech około 42% ¹, a w Szwajcarii badania na królikach domowych wykazały przeciwciała aż u 85% zwierząt, podczas gdy w populacji hodowlanej odsetek ten był znacznie niższy i wynosił około 7,5% ¹. We Włoszech badania na fermach mięsnych wykazały zakażenie u 31,6% z 1600 przebadanych zwierząt ¹⁰, natomiast wśród królików towarzyszących seropozytywność sięgała 67% ¹.

Poza Europą sytuacja wygląda podobnie. W Japonii przeciwciała IgG wykryto u 63,5% królików ¹, na Tajwanie u ponad 63% ¹, w Korei Południowej u około 30% badanych zwierząt, a w Brazylii aż u 81,7% ¹¹. Te imponujące liczby mogą budzić niepokój, jednak trzeba je interpretować właściwie. Seropozytywność oznacza jedynie tyle, że zwierzę w pewnym momencie swojego życia zetknęło się z pasożytem i wytworzyło przeciwko niemu przeciwciała. Nie oznacza to jednak, że jest ono chore ani że zachoruje w przyszłości. Zdecydowana większość zakażonych królików nie wykazuje objawów klinicznych, a seropozytywność bardzo często oznacza wyłącznie kontakt z pasożytem, nie chorobę ¹⁷.

Sprytna strategia przetrwania - cykl życiowy pasożyta

Cykl życiowy E. cuniculi jest bezpośredni, co oznacza, że pasożyt nie wymaga pośrednich żywicieli do zamknięcia cyklu rozwojowego ¹. Transmisja odbywa się głównie drogą poziomą - przede wszystkim przez połykanie spor pochodzących z moczu zakażonych zwierząt, a droga wziewna jest rozważana jako możliwa w określonych warunkach. Możliwe jest również zakażenie wertykalne, czyli przezłożyskowe przeniesienie pasożyta z matki na potomstwo, co ma szczególne znaczenie dla rozwoju zmian ocznych u młodych królików ¹¹².

Droga doustna pozostaje najczęstszą formą naturalnego zakażenia. Spory obecne w środowisku - na karmie, ściółce, w wodzie do picia lub po prostu na powierzchniach zanieczyszczonych moczem zakażonego zwierzęcia - są połykane przez nowego żywiciela. W eksperymentalnych modelach zakażenia wykazano również możliwość infekcji drogą wziewną, a także przez błony śluzowe, drogą dożylną, dooponową i doodbytniczą, choć te ostatnie mają znaczenie głównie w warunkach laboratoryjnych ¹.

Spora, czyli forma zakaźna pasożyta, to niezwykła konstrukcja biologiczna. Ma kształt owalny i typowo rozmiary rzędu około 1,5-2,5 µm (często opisywane jako około 2,5 × 1,5 µm, zależnie od metody preparatyki i opisu w danej pracy), jest więc zbyt mała, by zobaczyć ją gołym okiem, ale wystarczająco duża do identyfikacji mikroskopowej przy odpowiednim powiększeniu i barwieniu ¹¹³. Ściana spory składa się z wewnętrznej warstwy chitynowej (endospory) oraz zewnętrznej warstwy białkowej (egzospory), które zapewniają jej znaczną odporność na czynniki środowiskowe.Spory w preparatach histologicznych mogą barwić się Gram-dodatnio i mogą być uwidaczniane także metodami PAS, metodami o charakterze „kwasoopornym” (w wariantach modyfikowanych) oraz barwieniami trójchromowymi ¹¹³.

Wewnątrz spory znajduje się aparat niezbędny do infekcji: materiał genetyczny, jądro, wakuola tylna oraz najbardziej charakterystyczna struktura - rurka polarna zwinięta spiralnie wokół zawartości spory i zakotwiczona w przedniej części przez tak zwany dysk polarny ²³. To właśnie rurka polarna czyni mikrosporidię tak skutecznym pasożytem. Gdy spora znajdzie się w sprzyjającym środowisku - w przewodzie pokarmowym gospodarza, gdzie zmienia się pH i ciśnienie osmotyczne - dochodzi do procesu zwanego germinacją. Rurka polarna błyskawicznie się wydłuża i „wystrzeliwuje” niczym harpun, przebijając błonę komórkową komórki gospodarza i wstrzykując do jej wnętrza sporoplazmat, czyli materiał genetyczny i cytoplazmę pasożyta ²³.

Ten mechanizm infekcji jest bardzo skuteczny, a w sprzyjających warunkach umożliwia pasożytowi szybkie wprowadzenie sporoplazmatu do komórki gospodarza. Co więcej, opisywano, że spory E. cuniculi mogą zostać pobrane przez komórki na drodze fagocytozy - nie jest to jednak podstawowy mechanizm zakażenia mikrosporidiów, lecz raczej alternatywna droga internalizacji spory obserwowana w części modeli doświadczalnych ¹⁴. Po takim pobraniu opisywano zaburzenia dojrzewania fagosomu i/lub jego fuzji z lizosomem, co może sprzyjać przeżyciu pasożyta w komórce i unikaniu zniszczenia przez mechanizmy lizosomalne ¹⁵.

Po dostaniu się do wnętrza komórki sporoplazmat rozpoczyna intensywne namnażanie. Kolejne stadia rozwojowe - meronty, następnie sporonty i sporoblasty - powstają wewnątrz specjalnej struktury zwanej wakuolą parazytoforową, którą pasożyt tworzy w cytoplazmie komórki gospodarza ²³. Wakuola ta powiększa się stopniowo w miarę dojrzewania kolejnych pokoleń spor. Sporoblasty rozwijają swoją rurkę polarną, dysk polarny, wakuole oraz błonę plazmatyczną, ostatecznie przekształcając się w dojrzałe, zakaźne spory. Kiedy wakuola parazytoforowa wypełni się sporami do granic możliwości, komórka gospodarza pęka, uwalniając tysiące nowych zakaźnych cząstek, które mogą infekować kolejne komórki lub zostać wydalone do środowiska zewnętrznego ¹³

Podróż przez organizm - gdzie pasożyt się ukrywa

Po połknięciu spory i zakażeniu komórek nabłonka jelitowego pasożyt rozprzestrzenia się po organizmie drogą krwionośną. Zakażone makrofagi, które pochłonęły spory, ale nie zdołały ich zniszczyć, mogą przenosić pasożyta do węzłów chłonnych i dalej do różnych narządów. Wykazano również obecność wolnych spor w naczyniach krwionośnych nerek i żyle wrotnej ¹³.

Narządy, w których najchętniej osiedla się pasożyt, to przede wszystkim nerki i mózg, a także soczewka oka, płuca, wątroba i mięsień sercowy ¹¹⁶. Każda z tych lokalizacji ma swoje konsekwencje kliniczne, choć - co należy podkreślić - większość zakażonych królików pozostaje bezobjawowa. Spory mogą być wydalane z moczem po kilku tygodniach od zakażenia, a w badaniach eksperymentalnych opisywano ich obecność w moczu nawet do około 3 miesięcy po inokulacji; wydalanie może być zmienne w czasie (intermitentne), co utrudnia interpretację pojedynczych wyników ¹¹⁷. Co ważne, po okresie najbardziej intensywnego wydalania (zwykle pierwsze około 3 miesiące) ilość spor w moczu zwykle wyraźnie spada, ale u części zwierząt może dochodzić do późniejszego, przerywanego wydalania niewielkich ilości spor, dlatego nie da się uczciwie powiedzieć, że królik „na pewno przestaje zakażać” po zakończeniu tego etapu.

Mózg i rdzeń kręgowy bywają zajmowane później niż nerki, a w części modeli eksperymentalnych zmiany lub obecność patogenu w obrębie ośrodkowego układu nerwowego opisywano dopiero po kolejnych tygodniach od zakażenia ¹. Pasożyt może pozostawać w tkance nerwowej przez wiele lat, czasem przez całe życie zwierzęcia, w stanie uśpionym lub powodując powolne, przewlekłe uszkodzenia.

Kiedy układ odpornościowy trzyma straż

Odpowiedź immunologiczna na zakażenie E. cuniculi jest złożona i wielowarstwowa, jednak kluczową rolę odgrywa w niej odporność komórkowa, a nie humoralna ¹²¹⁸. To fundamentalnie ważna informacja dla zrozumienia zarówno przebiegu choroby, jak i ograniczeń diagnostyki serologicznej.

Limfocyty T, a szczególnie cytotoksyczne limfocyty CD8+, stanowią główną linię obrony przed tym wewnątrzkomórkowym pasożytem ¹⁸¹⁹. Badania na myszach pozbawionych grasicy (a więc niezdolnych do produkcji dojrzałych limfocytów T) wykazały, że zwierzęta te umierają z powodu zakażenia E. cuniculi, podczas gdy myszy z prawidłowym układem odpornościowym kontrolują infekcję i przeżywają ¹⁸¹⁹. Transfer uczulonych limfocytów T od zdrowych myszy do myszy z niedoborem odporności chronił je przed śmiertelnym zakażeniem, natomiast transfer samych przeciwciał - nie ¹¹⁸.

Interferon gamma (IFN-γ), kluczowa cytokina wydzielana przez aktywowane limfocyty T, odgrywa centralną rolę w kontroli zakażenia. Myszy pozbawione zdolności do produkcji IFN-γ lub leczone przeciwciałami neutralizującymi tę cytokinę ulegają śmiertelnej infekcji ²⁰. IFN-γ aktywuje makrofagi do skutecznego zabijania pochłoniętych pasożytów i stymuluje inne mechanizmy wrodzonej odporności.

A co z przeciwciałami? Wszystkie immunokompetentne zwierzęta narażone na kontakt z E. cuniculi wytwarzają przeciwciała, które mogą przetrwać przez całe życie żywiciela - i tu właśnie tkwi źródło wielu diagnostycznych frustracji ¹². Przeciwciała te nie zapewniają jednak ochrony przed ponownym zakażeniem ani nie eliminują pasożyta z organizmu ¹¹⁸. Eksperymentalne podanie hiperimunizowanej surowicy myszom pozbawionym odporności nie chroniło ich przed śmiertelnym zakażeniem ¹⁸. Oznacza to, że królik może w ciągu życia ponownie zachorować - najczęściej w wyniku reaktywacji zakażenia utrzymującego się w organizmie, a przy kolejnej ekspozycji również w wyniku reinfekcji - a obecność wysokich mian przeciwciał nie oznacza odporności.

Badania eksperymentalne wykazały znaczną zmienność odpowiedzi humoralnej między poszczególnymi osobnikami. U królików doświadczalnie zakażonych E. cuniculi obserwowano trzy różne wzorce odpowiedzi IgG: u niektórych zwierząt miana utrzymywały się na stałym poziomie, u innych rosły liniowo, a u jeszcze innych pozostawały niewykrywalne nawet 68 dni po zakażeniu ¹²¹. Ta zmienność zależy prawdopodobnie zarówno od indywidualnej reaktywności układu odpornościowego, jak i od dawki zakaźnej.

Kiedy cisza zamienia się w burzę - obraz kliniczny encefalitozoonozy

Większość królików żyje z E. cuniculi przez całe życie bez żadnych dolegliwości. Układ odpornościowy skutecznie trzyma pasożyta w ryzach, ograniczając jego replikację do poziomu, który nie powoduje uszkodzeń tkanek. Problem pojawia się, gdy ta delikatna równowaga zostanie zachwiana. Przewlekły stres, współistniejąca choroba, podeszły wiek, niedobory żywieniowe czy jakakolwiek forma immunosupresji, mogą spowodować reaktywację utajonego zakażenia i rozwój pełnoobjawowej choroby zwanej encefalitozoonozą ¹⁷²².

Objawy neurologiczne - gdy mózg pada ofiarą

Najczęstszą i najbardziej dramatyczną manifestacją kliniczną encefalitozoonozy są objawy neurologiczne wynikające z zajęcia ośrodkowego układu nerwowego. Charakterystyczny jest nagły początek - właściciel często jest w stanie dokładnie określić moment, kiedy zauważył pierwsze niepokojące znaki. Jeszcze rano królik był zupełnie normalny, a po południu leży na boku, niezdolny do utrzymania równowagi.

Przechył głowy (torticollis, wry neck) jest prawdopodobnie najbardziej rozpoznawalnym objawem encefalitozoonozy i to on najczęściej skłania właścicieli do pilnej wizyty u weterynarza ¹⁹²³. Głowa zwierzęcia jest stale przechylona w jedną stronę, czasem nieznacznie, czasem pod kątem niemal 90 stopni. Towarzyszą temu zazwyczaj inne objawy dysfunkcji przedsionkowej: oczopląs (mimowolne, rytmiczne ruchy gałek ocznych, zwykle poziome), ataksja (zaburzenia koordynacji ruchowej), zataczanie kręgów w kierunku przechyłu głowy oraz utrata zdolności do utrzymania prawidłowej postawy ciała ¹⁹²⁴.

W cięższych przypadkach królik może toczyć się wokół własnej osi, będąc niezdolnym do skorygowania pozycji ciała. To dramatyczne zjawisko bywa czasem mylone z napadami drgawkowymi, choć mechanizm jest zupełnie inny - zwierzę nie traci przytomności, a jedynie nie potrafi określić, gdzie jest góra, a gdzie dół ²⁴. Toczenie się może być tak gwałtowne, że prowadzi do poważnych urazów wtórnych - otarć rogówki oka leżącego przy podłodze, złamań kończyn czy urazów głowy.

Niektóre króliki wykazują niedowład lub porażenie tylnych kończyn (parapareza lub paraplegia), co jest wynikiem zajęcia rdzenia kręgowego lub obszarów mózgu odpowiedzialnych za kontrolę motoryczną ¹²⁵. Objawy mogą obejmować również drżenia, drgawki, zmiany zachowania, dezorientację czy ślepotę korową ¹⁹. W skrajnych przypadkach dochodzi do śmierci, choć zwykle nie bezpośrednio z powodu zakażenia, lecz w wyniku powikłań.

Paradoks neurologiczny EC polega na tym, że nasilenie objawów klinicznych nie koreluje z rozległością zmian histopatologicznych w mózgu ¹¹³²⁶. Badania porównujące obraz kliniczny z wynikami sekcji wykazały, że królik z drobnymi ogniskami zapalnymi może wykazywać dramatyczne objawy neurologiczne, podczas gdy inny z rozległymi zmianami ziarniakami pozostaje całkowicie bezobjawowy ¹³²⁶. Ta rozbieżność ma fundamentalne znaczenie praktyczne - nie możemy przewidzieć, u którego seropozytywnego zwierzęcia rozwinie się choroba ani jak ciężki będzie jej przebieg.

Csokai i współpracownicy w przełomowym badaniu z 2009 roku przeanalizowali histopatologicznie mózgi i nerki 71 królików - zarówno z objawami klinicznymi, jak i bezobjawowych nosicieli ²⁶. Wykazali, że kora mózgowa jest najczęściej zajętym regionem (u 97,5% zwierząt ze zmianami zapalnymi), natomiast móżdżek (55%) i jądra przedsionkowe (37,5%) - znacznie rzadziej ²⁶. Ziarniniaki stwierdzono u 77,5% zwierząt z zapaleniem mózgu, ale - co kluczowe - ich obecność nie korelowała z nasileniem objawów klinicznych ²⁶.

Choroba nerek - cichy niszczyciel

Drugim istotnym narządem docelowym są nerki. W przeciwieństwie do dramatycznych objawów neurologicznych, choroba nerek przebiega zwykle skrycie i podstępnie, często wykrywana dopiero przy okazji rutynowych badań biochemicznych lub - niestety - na stole sekcyjnym ¹⁹.

Przewlekłe śródmiąższowe zapalenie nerek o charakterze limfoplazmatycznym i ziarniniakowym prowadzi stopniowo do postępującej utraty funkcjonujących nefronów ¹¹³²⁷. Charakterystycznym obrazem makroskopowym, widocznym podczas sekcji, są mnogie drobne, białawe, lekko zapadnięte ogniska na powierzchni kory nerkowej - tak zwane guzkowate blizny lub pitting ¹³²⁷. Torebka nerkowa może być zrośnięta z miąższem, co utrudnia jej odpreparowanie.

Klinicznie choroba nerek manifestuje się objawami przewlekłej niewydolności: zwiększonym pragnieniem (polidypsja), wielomoczem (poliuria), utratą masy ciała mimo prawidłowego lub nawet zwiększonego apetytu, postępującym osłabieniem i odwodnieniem ¹⁹²⁴. W zaawansowanych przypadkach dołącza się anoreksja, spadek ilości oddawanego kału lub jego zanik (hipomotoryka jelit), biegunka, niedokrwistość oraz zaburzenia neurologiczne wtórne do mocznicy.

Oczy - okno do zakażenia

Trzecią klasyczną lokalizację E. cuniculi stanowią oczy, a konkretnie soczewka. Ta postać choroby ma szczególną patogenezę związaną z zakażeniem wewnątrzmacicznym. Pasożyt przekazany od ciężarnej samicy do płodu może osiedlić się w soczewce, która w życiu płodowym jest jeszcze pozbawiona torebki ochronnej ¹¹²²⁸. Przez miesiące lub nawet lata spory pozostają tam bezobjawowo, zamknięte wewnątrz soczewki jak w sejfie.

Problem ujawnia się zwykle między 6. miesiącem a 2. rokiem życia, kiedy z nieznanych przyczyn dochodzi do pęknięcia soczewki i uwolnienia jej zawartości do komory przedniej oka ¹²²⁸²⁹. Białka soczewki, normalnie izolowane od układu odpornościowego przez torebkę, zostają rozpoznane jako obce antygeny i wywołują gwałtowną reakcję zapalną. Powstaje tak zwane fakoklastyczne zapalenie błony naczyniowej (phacoclastic uveitis), charakteryzujące się intensywnym bólem oka, zaczerwienieniem, łzawieniem, mruganiem i światłowstrętem ²⁸²⁹.

Typowym objawem jest obecność białawej masy wewnątrz oka, czasem z widocznym ropnym wysiękiem w komorze przedniej (hypopyon) ²⁸²⁹. Zaćma, czyli zmętnienie soczewki, jest praktycznie stałym elementem obrazu klinicznego. W przeciwieństwie do większości infekcji bakteryjnych, które zwykle dotyczą obu oczu symetrycznie, fakoklastyczne zapalenie wywołane E. cuniculi jest niemal zawsze jednostronne ¹²⁹. Ta asymetria ma wartość różnicującą i stanowi ważną wskazówkę diagnostyczną.

Inne narządy - ukryte konsekwencje

Chociaż mózg, nerki i oczy są najczęściej omawianymi lokalizacjami E. cuniculi, pasożyt może kolonizować również inne narządy. Wątroba, płuca i serce wykazują często zmiany zapalne przy badaniu histopatologicznym, nawet jeśli nie manifestowały się one klinicznie za życia zwierzęcia ¹¹³²⁷.

W wątrobie obserwuje się łagodne zwyrodnienie hepatocytów w strefie centralnej zrazika oraz okołowrotne nacieki komórek jednojądrzastych ¹³. W płucach stwierdza się nacieki śródmiąższowe i degenerację komórek z przekrwieniem naczyń włosowatych ¹³. W śledzionie opisywano nacieki limfocytarne i przekrwienie miazgi czerwonej ¹³. W mięśniu sercowym stwierdzano ogniska limfocytarnego zapalenia ¹¹³.

Diagnostyczne łamigłówki

Rozpoznanie encefalitozoonozy za życia zwierzęcia stanowi prawdziwe wyzwanie i źródło nieustannych frustracji zarówno dla lekarzy, jak i dla właścicieli. Żaden pojedynczy test nie pozwala na jednoznaczne potwierdzenie, że aktualnie obserwowane objawy kliniczne są rzeczywiście spowodowane przez E. cuniculi ¹⁹¹³. Diagnostyka opiera się więc na kombinacji badań, wykluczaniu innych możliwych przyczyn i - nierzadko - na próbie terapeutycznej.

Serologia - co naprawdę nam mówi

Podstawowym narzędziem diagnostycznym pozostaje serologia, czyli wykrywanie przeciwciał przeciwko E. cuniculi w surowicy krwi. Najczęściej stosowane metody to test immunoenzymatyczny ELISA oraz immunofluorescencja pośrednia (IFA), które dają porównywalne wyniki ¹³⁰. Dostępny jest również test immunoabsorpcji węglowej (CIA), stosowany w niektórych laboratoriach europejskich ⁹.

Interpretacja wyników serologicznych jest jednak znacznie bardziej skomplikowana, niż mogłoby się wydawać. Pojedynczy wynik dodatni mówi jedynie tyle, że zwierzę kiedykolwiek zetknęło się z pasożytem ¹⁹. Może to oznaczać świeże zakażenie (w ciągu ostatnich 2-3 tygodni), przewlekłą aktywną infekcję, zakażenie kontrolowane przez układ odpornościowy i przebiegające bezobjawowo, lub stan po przebytym zakażeniu, które wygasło klinicznie. Co więcej, ze względu na powszechność zakażenia w populacji królików (przypomnijmy - 50-80% seropozytywnych), dodatni wynik serologiczny u pacjenta z objawami neurologicznymi może być czystą koincydencją, a prawdziwa przyczyna dolegliwości leży gdzie indziej ¹¹³.

Pewną wartość diagnostyczną ma oznaczanie obu klas przeciwciał równocześnie - IgG i IgM ⁹²¹³⁰. Obecność wysokich mian zarówno IgG, jak i IgM sugeruje ostre, niedawne zakażenie lub reaktywację. Wysokie IgG przy nieobecnym IgM wskazują raczej na kontakt w przeszłości i nie świadczą o aktywnej chorobie. Izolowana obecność IgM bez IgG może wskazywać na bardzo wczesną fazę zakażenia (pierwsze 2-3 tygodnie), gdy IgG nie zdążyły się jeszcze wytworzyć ⁹²¹.

Co kluczowe, miana przeciwciał nie korelują z nasileniem choroby ani stopniem zajęcia poszczególnych narządów ¹⁹¹³. Królik z niskimi mianami może ciężko chorować, podczas gdy inny z bardzo wysokimi mianami pozostaje całkowicie zdrowy. Wynika to z faktu, że to nie przeciwciała kontrolują zakażenie - robią to limfocyty T, których aktywności nie mierzymy standardowymi testami serologicznymi.

Ujemny wynik serologiczny u immunokompetentnego zwierzęcia z objawami neurologicznymi ma natomiast znaczną wartość wykluczającą ¹. Jeśli wynik jest ujemny, a zwierzę nie jest w stanie immunosupresji, zakażenie E. cuniculi można z dużym prawdopodobieństwem wykluczyć jako przyczynę aktualnych objawów. Zaleca się jednak powtórzenie badania po 2-3 tygodniach, aby upewnić się, że ujemny wynik nie był fałszywie ujemny z powodu zbyt wczesnego momentu pobrania krwi ¹⁹.

Techniki molekularne - nadzieja z ograniczeniami

Diagnostyka molekularna oparta na reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) teoretycznie powinna umożliwiać bezpośrednie wykrycie DNA pasożyta w płynach i tkankach. W praktyce jednak wyniki badań PCR w diagnostyce E. cuniculi są rozczarowujące i niejednorodne ¹⁹¹³.

Wykrywanie DNA pasożyta w moczu ma sens biologiczny, ponieważ nerki są głównym miejscem wydalania spor. Jednak badania wykazały zmienną czułość tego testu. Csokai i współpracownicy wykryli DNA E. cuniculi w moczu zaledwie u 29,7% badanych zwierząt seropozytywnych ³¹, podczas gdy Sieg i współpracownicy odnotowali pozytywny wynik u 48,7% ³². To oznacza, że w momencie pobierania próbki zwierzę może już nie wydalać spor, co daje wynik fałszywie ujemny.

Wyjątek stanowi PCR materiału z soczewki u królików z fakoklastycznym zapaleniem błony naczyniowej. W tej lokalizacji, gdzie stężenie spor jest bardzo wysokie, czułość i swoistość badania molekularnego są doskonałe i uznaje się je za złoty standard przyżyciowej diagnostyki tej postaci choroby ¹³³³⁴.

Diagnostyka różnicowa - co jeszcze może powodować przechył głowy

Lista chorób, które mogą dawać objawy podobne do encefalitozoonozy, jest długa i obejmuje zarówno przyczyny infekcyjne, jak i nieinfekcyjne ¹⁶³⁵. Właściwa diagnostyka różnicowa jest kluczowa, ponieważ niektóre z tych stanów wymagają zupełnie innego postępowania.

Bakteryjne zapalenie ucha środkowego i wewnętrznego, najczęściej wywoływane przez Pasteurella multocida, stanowi główną konkurencyjną przyczynę przechyłu głowy u królików ¹³⁵³⁶. Zakażenie szerzy się zwykle drogą wstępującą z jamy nosowej przez trąbkę słuchową do ucha środkowego, a następnie wewnętrznego. Ropień może rozprzestrzeniać się również do mózgu, powodując zapalenie opon i mózgu. W przeciwieństwie do encefalitozoonozy, bakteryjne zapalenie ucha częściej wiąże się z wcześniejszymi epizodami nieżytu nosa.

Inne bakterie mogące powodować zapalenie opon i mózgu to Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa i Listeria monocytogenes ⁶. Przyczyny nieinfekcyjne obejmują nowotwory (zwłaszcza chłoniaki i przerzuty), zatrucie ołowiem, wodogłowie, udary mózgu, encefalopatię wątrobową oraz urazy głowy ⁶³⁵.

Badanie pośmiertne - ostateczna odpowiedź

Definitywne rozpoznanie encefalitozoonozy możliwe jest wyłącznie na podstawie badania histopatologicznego tkanek pobranych podczas sekcji ¹¹³. Makroskopowo zmiany w mózgu są zwykle niewidoczne - mózg wygląda prawidłowo. Natomiast nerki często wykazują charakterystyczny obraz przewlekłego zapalenia: mnogie drobne, białawe, lekko zapadnięte ogniska na powierzchni kory ¹³²⁷.

Mikroskopowo w mózgu stwierdza się ogniskowe lub wieloogniskowe, ropiejąco-ziarniniakowe lub nieropne zapalenie mózgu i opon z towarzyszącą glejozą i astrocytozą oraz limfoplazmatycznymi mankietami okołonaczyniowymi ¹¹³²⁷. W nerkach dominuje przewlekłe śródmiąższowe zapalenie o charakterze limfoplazmatycznym do ziarniniakowego z towarzyszącym włóknieniem ¹³²⁷.
Spory pasożyta można identyfikować w barwieniu hematoksyliną i eozyną, ale ich wykrycie ułatwiają barwienia specjalne: metoda Grama (spory barwią się Gram-dodatnio), metoda PAS, metoda kwasoodporna Ziehl-Neelsena oraz zmodyfikowane barwienia trójchromowe ¹¹³.

Terapia pełna znaków zapytania

Leczenie encefalitozoonozy pozostaje tematem kontrowersji, rozczarowań i toczących się debat. Mimo dekad badań wciąż nie dysponujemy terapią, która w sposób pewny i powtarzalny eliminowałaby pasożyta z organizmu zakażonego zwierzęcia i cofałaby objawy kliniczne. Podejście terapeutyczne opiera się na kilku filarach: ograniczeniu namnażania i rozprzestrzeniania się pasożyta, zmniejszeniu stanu zapalnego odpowiedzialnego za objawy, leczeniu wspomagającym i pielęgnacji oraz modyfikacji środowiska.

Fenbendazol - nadzieja z ograniczeniami

Podstawą współczesnych protokołów leczniczych jest fenbendazol, benzimidazol stosowany rutynowo jako środek przeciwpasożytniczy u wielu gatunków zwierząt ¹³⁷. Mechanizm jego działania polega na wiązaniu się z tubuliną pasożyta i zaburzaniu funkcji mikrotubul, co uniemożliwia prawidłowy podział komórek i transport wewnątrzkomórkowy ³⁷. Co istotne, dane eksperymentalne pokazują, że przy dawkowaniu stosowanym u królików fenbendazol wiąże się z eliminacją/ograniczeniem obecności pasożyta w tkankach OUN w określonych modelach, co jest jedną z przesłanek jego użyteczności w tej chorobie ³⁷³⁸.

Przełomowe badanie Suter i współpracowników z 2001 roku stanowi fundament obecnych rekomendacji ³⁷. W tym kontrolowanym eksperymencie wykazano, że profilaktyczne podawanie fenbendazolu w dawce 20 mg/kg masy ciała raz dziennie przez okres od 7 dni przed do 2 lub 21 dni po eksperymentalnym zakażeniu skutecznie zapobiegało rozwojowi infekcji. Króliki pozostawały seronegatywne po 21 dniach, a spor nie izolowano z tkanki mózgowej przy sekcji ³⁷. Co równie istotne, u naturalnie zakażonych, seropozytywnych królików terapia fenbendazolem przez 4 tygodnie eliminowała spory z mózgu ³⁷.

Te obiecujące wyniki sprawiły, że fenbendazol stał się standardem zarówno w profilaktyce, jak i w leczeniu zwierząt z objawami klinicznymi. Rekomendowana dawka to 20 mg/kg masy ciała raz dziennie przez 28 dni ¹³⁷³⁸.

Jednak praktyka kliniczna okazała się mniej różowa niż wyniki badań eksperymentalnych. Kolejne publikacje wykazały, że o ile profilaktyka działa dobrze, o tyle leczenie zwierząt z już rozwiniętą chorobą neurologiczną przynosi znacznie gorsze efekty ³²³⁸³⁹. Retrospektywne badanie Sieg i współpracowników obejmujące 95 królików z objawami przedsionkowymi wykazało, że włączenie fenbendazolu do protokołu terapeutycznego zwiększało szanse przeżycia do 10. dnia leczenia, poprawiało wyniki oceny neurologicznej i zwiększało długoterminowe przeżycie, jednak po 10 dniach efekt terapeutyczny nie był już statystycznie istotny ³².

W innym badaniu Künzel i współpracownicy oceniali skuteczność skojarzonej terapii fenbendazolem, oksytetracykliną, enrofloksacyną i deksametazonem lub prednizonem ³³. Skuteczność kliniczna (poprawa lub wyleczenie) wynosiła około 54% - co oznacza, że niemal połowa pacjentów nie odpowiedziała na leczenie lub zmarła ³³.

Problem polega na tym, że u królików z zaawansowanym stanem zapalnym w ośrodkowym układzie nerwowym eliminacja spor niekoniecznie przekłada się na poprawę kliniczną ¹³⁹. Uszkodzenia tkanki nerwowej powstałe w wyniku przewlekłego zapalenia są w dużej mierze nieodwracalne. Fenbendazol może powstrzymać dalsze namnażanie pasożyta i zapobiec pogorszeniu, ale nie jest w stanie cofnąć zmian, które już nastąpiły.

Kontrowersje wokół sterydów

Kwestia stosowania glikokortykosteroidów w encefalitozoonozie pozostaje jednym z najbardziej dyskutowanych tematów w medycynie królików. Z jednej strony ziarniniakowe stany zapalne w mózgu teoretycznie powinny reagować na leki przeciwzapalne o silnym działaniu immunomodulującym. Z drugiej strony - deksametazon i inne glikokortykoidy wykazują silne działanie immunosupresyjne, a odpowiedź immunologiczna komórkowa jest kluczowa dla kontroli pasożyta ¹³⁹.

Badania na modelach mysich wykazały, że immunosupresja wywołana deksametazonem potęguje przebieg choroby, prowadząc do intensywniejszego namnażania pasożyta i cięższych objawów klinicznych ⁴⁰. W kontrolowanych badaniach klinicznych u królików deksametazon nie wpływał ani na wyniki oceny neurologicznej, ani na przeżycie krótko- czy długoterminowe ³². Z tych powodów większość specjalistów obecnie odradza rutynowe stosowanie glikokortykosteroidów w EC ¹³⁹.

Leczenie wspomagające - często decydujące

Niezależnie od stosowanego leczenia celowanego, kluczowe znaczenie ma kompleksowa opieka wspomagająca, która często decyduje o przeżyciu pacjenta i jakości jego życia ¹²⁴³⁹.

Płynoterapia jest niezbędna u pacjentów odwodnionych, anorektycznych lub z upośledzoną funkcją nerek. Wsparcie żywieniowe ma fundamentalne znaczenie - króliki z objawami przedsionkowymi często przestają jeść z powodu nudności, dezorientacji lub niemożności utrzymania prawidłowej postawy przy misce. Anoreksja u królika jest stanem zagrażającym życiu - już po 24-48 godzinach bez jedzenia może dojść do lipidozy wątroby i stazy przewodu pokarmowego. Karmienie wspomagane specjalnymi preparatami jest często niezbędne przez pierwsze dni lub tygodnie leczenia.

Modyfikacje środowiska są absolutnie niezbędne. Królik z zaburzeniami równowagi potrzebuje miękkiego, wyściełanego pomieszczenia bez ostrych krawędzi i metalowych elementów. Szczególną uwagę należy poświęcić tak zwanemu „oku dolnemu” u królików z przechyłem głowy ²⁴. Oko po stronie przechyłu często kontaktuje się z podłożem i jest narażone na otarcia rogówki, wysychanie i wtórne zakażenia.

Rokowanie - nadzieja mimo wszystko

Rokowanie w encefalitozoonozie jest zmienne i trudne do przewidzenia. Pacjenci z łagodnym przechyłem głowy, zachowanym apetytem i dobrą kondycją ogólną mają dobre rokowanie. Wielu z nich powraca do niemal normalnego funkcjonowania, choć część pozostaje z resztkowym, niewielkim przechyłem głowy do końca życia. Ten resztkowy przechył rzadko przeszkadza w codziennych czynnościach - króliki uczą się kompensować deficyt i żyją szczęśliwie przez wiele lat ²⁴⁴¹.

Pacjenci z ciężkimi objawami - gwałtownym toczeniem się, porażeniem kończyn, anoreksją, odwodnieniem - mają rokowanie ostrożne do złego ¹³⁵. Część z nich umiera mimo intensywnego leczenia. Istnieją jednak przypadki spektakularnych powrotów do zdrowia nawet u królików, które początkowo wyglądały beznadziejnie ⁴¹. Dlatego większość specjalistów zaleca podjęcie próby leczenia i obserwację przez co najmniej 2-4 tygodnie przed podjęciem decyzji o eutanazji ²⁴³⁹.

Zagrożenie dla człowieka - zoonoza, którą warto znać

Encephalitozoon cuniculi jest uznawany za patogen zoonotyczny, choć przypadki zakażeń u ludzi pozostają stosunkowo rzadkie w porównaniu z powszechnością zakażenia w populacjach zwierząt ⁵⁴²⁴³. Większość opisanych infekcji ludzkich dotyczyła osób z upośledzoną odpornością - pacjentów z AIDS, po przeszczepach narządów, otrzymujących chemioterapię, z wrodzonymi niedoborami odporności lub w podeszłym wieku ⁴²⁴³⁴⁴.

U osób immunokompromitowanych E. cuniculi może wywoływać poważne, wielonarządowe zakażenia obejmujące zapalenie mózgu, niewydolność nerek, zapalenie rogówki i spojówek, zapalenie płuc, zapalenie wątroby, zapalenie otrzewnej i rozsiane zakażenie prowadzące do śmierci ⁴²⁴³⁴⁴. Weber i współpracownicy opisali w prestiżowym New England Journal of Medicine przypadek mózgowej mikrosporidiozy u pacjenta z HIV, który prezentował objawy neurologiczne i u którego spory wykryto w płynie mózgowo-rdzeniowym ⁴⁴.

Badania serologiczne wykazują, że kontakt z pasożytem w ogólnej populacji ludzkiej jest częstszy, niż mogłyby sugerować rzadkie przypadki kliniczne. W Egipcie przeciwciała przeciwko E. cuniculi wykryto u 11% zdrowych osób oraz u 77% pacjentów z immunosupresją ⁴⁵. Prawdopodobnie większość osób immunokompetentnych nabywa zakażenie bezobjawowo i skutecznie je kontroluje.

Zalecane środki ostrożności obejmują ¹⁵⁴⁶: dokładne mycie rąk po kontakcie z królikiem i sprzątaniu jego środowiska, unikanie kontaktu z moczem zwierzęcia, regularne usuwanie zanieczyszczeń i dezynfekcję klatek. Spory E. cuniculi dają się unieszkodliwiać chemicznie, ale czas kontaktu ma kluczowe znaczenie: w badaniach in vitro wykazywano, że 70% etanol unieczynniał spory już po 30 sekundach, 1-10% wybielacz był skuteczny po 30 sekundach, natomiast 0,1% roztwór wybielacza wymagał około 7 minut lub dłużej; w badaniu testy prowadzono w 4°C, więc w temperaturze pokojowej skuteczność może być co najmniej podobna, ale w praktyce kluczowe jest zapewnienie realnego czasu zwilżenia powierzchni ⁴⁶

Profilaktyka - lepiej zapobiegać niż leczyć

Całkowita eliminacja E. cuniculi z populacji królików domowych nie jest realistycznym celem, biorąc pod uwagę skalę seroprewalencji sięgającą 50-80% i bezobjawowy charakter większości zakażeń. Celem profilaktyki jest raczej ograniczenie transmisji, identyfikacja zwierząt wysokiego ryzyka i zapobieganie rozwojowi choroby klinicznej u nosicieli.

Nowo nabyte króliki powinny być poddane kwarantannie przed wprowadzeniem do stada lub domu z innymi królikami ¹. Niektórzy hodowcy stosują profilaktyczną kurację fenbendazolem (20 mg/kg dziennie przez 28 dni) u wszystkich nowo przyjętych zwierząt, niezależnie od statusu serologicznego ¹³⁷. Regularne utrzymywanie czystości w środowisku życia królików ogranicza ryzyko transmisji - codzienne usuwanie kału i mokrej ściółki, cotygodniowa gruntowna wymiana podłoża i dezynfekcja powierzchni zmniejszają stężenie spor w środowisku ¹⁴⁶.

Ponieważ reaktywacja latentnego zakażenia wiąże się z osłabieniem układu odpornościowego, minimalizacja stresu w życiu królika ma znaczenie profilaktyczne ¹⁷²². Zbilansowana dieta, stały dostęp do siana i świeżej wody, odpowiednia przestrzeń życiowa, towarzystwo, unikanie nagłych zmian i regularna kontrola weterynaryjna - to wszystko składa się na profilaktykę nie tylko encefalitozoonozy, ale wielu innych chorób.

Perspektywy na przyszłość

Encefalitozoonoza pozostaje chorobą frustrującą zarówno dla lekarzy, jak i właścicieli królików. Diagnostyka opiera się na prawdopodobieństwie raczej niż pewności, terapia daje nieprzewidywalne rezultaty, a rokowanie - nawet przy intensywnym leczeniu - bywa niepewne. Mimo to jest to choroba, z którą można żyć, a w wielu przypadkach skutecznie sobie radzić.

Z perspektywy naukowej pozostaje wiele pytań bez odpowiedzi. Dlaczego u jednych zwierząt pasożyt pozostaje uśpiony przez całe życie, podczas gdy u innych wywołuje pełnoobjawową chorobę? Jakie czynniki genetyczne lub epigenetyczne gospodarza i pasożyta decydują o przebiegu zakażenia? Czy możliwe jest opracowanie skutecznej szczepionki?

Dla opiekunów królików najważniejsze jest zrozumienie, że dodatni wynik serologiczny nie jest wyrokiem. Większość seropozytywnych królików nigdy nie zachoruje. A jeśli objawy się pojawią - szybka reakcja, właściwa diagnostyka, cierpliwe leczenie i dobra opieka dają realną szansę na powrót do zdrowia lub przynajmniej do akceptowalnej jakości życia. Encephalitozoon cuniculi to przeciwnik trudny, ale nie niepokonany.

Bibliografia

1. Latney LV, Bradley CW, Wyre NR. Encephalitozoon cuniculi in pet rabbits: diagnosis and optimal management. Vet Med (Auckl). 2014;5:169-180. doi:10.2147/VMRR.S49842
2. Künzel F, Joachim A. Encephalitozoonosis in rabbits. Parasitol Res. 2010;106(2):299-309. doi:10.1007/s00436-009-1679-3
3. Bohne W, Böttcher K, Gross U. The parasitophorous vacuole of Encephalitozoon cuniculi: biogenesis and characteristics of the host cell-pathogen interface. Int J Med Microbiol. 2011;301(5):395-399. doi:10.1016/j.ijmm.2011.04.006
4. Wright JH, Craighead EM. Infectious motor paralysis in young rabbits. J Exp Med. 1922;36(1):135-140. doi:10.1084/jem.36.1.135
5. Mathis A, Weber R, Deplazes P. Zoonotic potential of the microsporidia. Clin Microbiol Rev. 2005;18(3):423-445. doi:10.1128/CMR.18.3.423-445.2005
6. Doboși AA, Paștiu AI, et al. A Review of Encephalitozoon cuniculi in Domestic Rabbits-Biology, Clinical Signs, Diagnostic Techniques, Treatment, and Prevention. Pathogens. 2022;11(12):1486. doi:10.3390/pathogens11121486
7. Harcourt-Brown FM. Encephalitozoon cuniculi infection in rabbits. Semin Avian Exot Pet Med. 2004;13(2):86-93. doi:10.1053/j.saep.2004.01.004
8. Keeble EJ, Shaw DJ. Seroprevalence of antibodies to Encephalitozoon cuniculi in domestic rabbits in the United Kingdom. Vet Rec. 2006;158(16):539-544. doi:10.1136/vr.158.16.539
9. Škrbinšek AM, et al. Encephalitozoon cuniculi Infection of Domestic Rabbits in Slovenia between 2017 and 2021. Pathogens. 2023;12(4):516. doi:10.3390/pathogens12040516
10. Santaniello A, et al. Serological survey of Encephalitozoon cuniculi in farm rabbits in Italy. Res Vet Sci. 2009;87(1):67-69. doi:10.1016/j.rvsc.2008.12.008
11. Berger Baldotto S, Cray C, Giannico AT, Reifur L, Montiani-Ferreira F. Seroprevalence of Encephalitozoon cuniculi Infection in Pet Rabbits in Brazil. J Exot Pet Med. 2015;24(4):435-440. doi:10.1053/j.jepm.2015.08.010
12. Owen DG, Gannon J. Investigation into the transplacental transmission of Encephalitozoon cuniculi in rabbits. Lab Anim. 1980;14(1):35-38. doi:10.1258/002367780780935730
13. Rodríguez-Tovar LE, et al. Encephalitozoon cuniculi: Grading the histological lesions in brain, kidney, and liver during primoinfection outbreak in rabbits. J Pathog. 2016;2016:5768428. doi:10.1155/2016/5768428
14. Couzinet S, et al. Phagocytic uptake of Encephalitozoon cuniculi by nonprofessional phagocytes. Infect Immun. 2000;68(12):6939-6945. doi:10.1128/IAI.68.12.6939-6945.2000
15. Franzen C, Müller A, Hartmann P, Salzberger B. Cell invasion and intracellular fate of Encephalitozoon cuniculi (Microsporidia). Parasitology. 2005;130(3):285-292. doi:10.1017/S003118200400633X
16. Cox JC, Hamilton RC, Attwood HD. An investigation of the route and progression of Encephalitozoon cuniculi infection in adult rabbits. J Protozool. 1979;26(2):260-265. doi:10.1111/j.1550-7408.1979.tb02776.x
17. Cox JC, Gallichio HA. Serological and histological studies on adult rabbits with recent, naturally acquired encephalitozoonosis. Res Vet Sci. 1978;24(2):260-261.
18. Valencakova A, Halanova M. Immune response to Encephalitozoon infection review. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 2012;35(1):1-7. doi:10.1016/j.cimid.2011.11.004
19. Khan IA, Schwartzman JD, Kasper LH, Moretto M. CD8+ CTLs are essential for protective immunity against Encephalitozoon cuniculi infection. J Immunol. 1999;162(10):6086-6091. doi:10.4049/jimmunol.162.10.6086
20. Didier ES, et al. Microsporidiosis in mammals. Microbes Infect. 2000;2(6):709-720. doi:10.1016/S1286-4579(00)00354-3
21. Jeklová E, et al. Experimental oral and ocular Encephalitozoon cuniculi infection in rabbits. Parasitology. 2010;137(12):1749-1757. doi:10.1017/S0031182010000648
22. Wasson K, Peper RL. Mammalian microsporidiosis. Vet Pathol. 2000;37(2):113-128. doi:10.1354/vp.37-2-113
23. Gruber A, Pakozdy A, Weissenböck H, Csokai J, Künzel F. A retrospective study of neurological disease in 118 rabbits. J Comp Pathol. 2009;140(1):31-37. doi:10.1016/j.jcpa.2008.09.009
24. Varga M. Textbook of Rabbit Medicine. 2nd ed. Elsevier; 2014.
25. Percy DH, Barthold SW. Pathology of Laboratory Rodents and Rabbits. 3rd ed. Blackwell Publishing; 2007.
26. Csokai J, et al. Encephalitozoonosis in pet rabbits: pathohistological findings in animals with latent infection versus clinical manifestation. Parasitol Res. 2009;104(3):629-635. doi:10.1007/s00436-008-1239-2
27. Leipig M, et al. Value of histopathology, immunohistochemistry, and real-time polymerase chain reaction in the confirmatory diagnosis of Encephalitozoon cuniculi infection in rabbits. J Vet Diagn Invest. 2013;25(1):16-26. doi:10.1177/1040638712466394
28. Felchle LM, Sigler RL. Phacoemulsification for the management of Encephalitozoon cuniculi-induced phacoclastic uveitis in a rabbit. Vet Ophthalmol. 2002;5(3):211-215. doi:10.1046/j.1463-5224.2002.00240.x
29. Giordano C, et al. Immunohistochemical identification of Encephalitozoon cuniculi in phacoclastic uveitis in four rabbits. Vet Ophthalmol. 2005;8(4):271-275. doi:10.1111/j.1463-5224.2005.00394.x
30. Boot R, et al. Comparison of assays for antibodies to Encephalitozoon cuniculi in rabbits. Lab Anim. 2000;34(3):281-289. doi:10.1258/002367700780384726
31. Csokai J, et al. Diagnostic markers for encephalitozoonosis in pet rabbits. Vet Parasitol. 2009;163(1-2):18-26. doi:10.1016/j.vetpar.2009.03.057
32. Sieg J, et al. Clinical evaluation of therapeutic success in rabbits with suspected encephalitozoonosis. Vet Parasitol. 2012;187(1-2):328-332. doi:10.1016/j.vetpar.2011.12.014
33. Künzel F, et al. Clinical symptoms and diagnosis of encephalitozoonosis in pet rabbits. Vet Parasitol. 2008;151(2-4):115-124. doi:10.1016/j.vetpar.2007.11.005
34. Stiles J, et al. Encephalitozoon cuniculi in the lens of a rabbit with phacoclastic uveitis: confirmation and treatment. Vet Comp Ophthalmol. 1997;7:233-238.
35. Kunstýř I, Naumann S. Head tilt in rabbits caused by pasteurellosis and encephalitozoonosis. Lab Anim. 1985;19(3):208-213. doi:10.1258/002367785780893548
36. Harcourt-Brown FM. Neurological and locomotor disorders. In: Textbook of Rabbit Medicine. 2nd ed. Elsevier; 2014:367-389.
37. Suter C, et al. Prevention and treatment of Encephalitozoon cuniculi infection in rabbits with fenbendazole. Vet Rec. 2001;148(15):478-480. doi:10.1136/vr.148.15.478
38. Abu-Akkada SS, Oda SS. Prevention and treatment of Encephalitozoon cuniculi infection in immunosuppressed rabbits with fenbendazole. Iran J Vet Res. 2016;17(2):98-105. doi:10.22099/ijvr.2016.3733
39. Fisher PG, Künzel F. Clinical Signs, Diagnosis, and Treatment of Encephalitozoon cuniculi Infection in Rabbits. Vet Clin North Am Exot Anim Pract. 2018;21(1):69-82. doi:10.1016/j.cvex.2017.08.002
40. Lallo MA, et al. Experimental Encephalitozoon cuniculi infection in dexamethasone-immunosuppressed mice. Rev Saude Publica. 2002;36(5):621-626. doi:10.1590/S0034-89102002000600012
41. Krempels DM. Head Tilt in Rabbits: Dont Give Up. House Rabbit Society.
42. Deplazes P, et al. Immunologic and molecular characteristics of Encephalitozoon-like microsporidia isolated from humans and rabbits indicate that Encephalitozoon cuniculi is a zoonotic parasite. Clin Infect Dis. 1996;22(3):557-559. doi:10.1093/clinids/22.3.557
43. Didier ES, Weiss LM. Microsporidiosis: not just in AIDS patients. Curr Opin Infect Dis. 2011;24(5):490-495. doi:10.1097/QCO.0b013e32834aa152
44. Weber R, et al. Cerebral microsporidiosis due to Encephalitozoon cuniculi in a patient with human immunodeficiency virus infection. N Engl J Med. 1997;336(7):474-478. doi:10.1056/NEJM199702133360704
45. Ashmawy KI, et al. Encephalitozoon cuniculi infection among immunocompromised and immunocompetent humans in Egypt. Iran J Parasitol. 2015;10(4):561-570
46. Jordan CN, et al. Activity of bleach, ethanol and two commercial disinfectants against spores of Encephalitozoon cuniculi. Vet Parasitol. 2006;136(3-4):343-346. doi:10.1016/j.vetpar.2005.11.005